Η διαδικασία παραγωγής της ηλεκτροφόρησης γέλης πολυακρυλαμιδίου (PAGE) περιλαμβάνει κυρίως στάδια όπως η προετοιμασία γέλης, η λειτουργία ηλεκτροφόρησης, η χρώση και η παρατήρηση των αποτελεσμάτων.
Προετοιμασία γέλης Προετοιμασία διαχωρισμού γέλης (10%): Αναμίξτε 0 ml ddH2O, 3 mL μητρικής γέλης 30%, 5 mL 5 mol/L Tris-HCl, 1 mL 10% SDS και 1 mL 10% AP, προσθέστε 10 μL από τον πυθμένα και προσθέστε το μL TEMED και στη συνέχεια προσθέστε καλά σε TEMED. Ρίξτε αυτό το μείγμα ανάμεσα στις γυάλινες πλάκες, σφραγίστε την κορυφή με νερό και περιμένετε 30~60 λεπτά για να πολυμεριστεί τελείως η γέλη.
Παρασκευή γέλης στοίβαξης (4%): Αναμείξτε 4 ml ddH2O, 33 ml μητρικής γέλης 30%, 25 ml 1 mol/L Tris{6}}HCl, 0,2 ml 10% SDS και 0,2 ml 10% AP, προσθέστε 2 μL TEMED και ανακατέψτε αμέσως καλά. Ρίξτε το νερό στο διαχωριστικό πήκτωμα, προσθέστε αυτό το μείγμα και εισάγετε αμέσως τη χτένα ανάμεσα στις γυάλινες πλάκες, περιμένοντας 15-30 λεπτά για να πολυμεριστεί τελείως η γέλη στοίβαξης.
Λειτουργία ηλεκτροφόρησης Επεξεργασία δείγματος: Αναμείξτε το δείγμα με ίση ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης 2XSDS, θερμάνετε στους 100 βαθμούς για 3-5 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm για 1 λεπτό και πάρτε το υπερκείμενο για ανάλυση SDS-PAGE.
Φόρτωση: Πάρτε 10 μL επαγόμενων και μη επαγόμενων δειγμάτων και προσθέστε τα στη δεξαμενή δειγμάτων και προσθέστε 20 μL προτύπων πρωτεΐνης χαμηλού μοριακού βάρους ως μάρτυρα.
Ηλεκτροφόρηση: Προσθέστε 1Χ buffer ηλεκτροφόρησης στη δεξαμενή ηλεκτροφόρησης, συνδέστε το τροφοδοτικό, διατηρήστε την τάση της γέλης στοίβαξης στα 60 V και την τάση της γέλης διαχωρισμού στα 100 V. Όταν το μπλε της βρωμοφαινόλης φτάσει στον πυθμένα της δεξαμενής ηλεκτροφόρησης, σταματήστε την ηλεκτροφόρηση (περίπου 3 ώρες).
Βαφή και παρατήρηση αποτελεσμάτων
Χρώση: Αφαιρέστε το τζελ από τη γυάλινη πλάκα και χρωματίστε το με διάλυμα χρώσης Coomassie Brilliant Blue για 4 έως 6 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Αποχρωματισμός: Τοποθετήστε το χρωματισμένο τζελ σε διάλυμα αποχρωματισμού και αποχρωματίστε το αρκετές φορές μέχρι να είναι καθαρά ορατή η ταινία πρωτεΐνης. Παρατήρηση των αποτελεσμάτων: Μετά την αποχρωματισμό, η γέλη μπορεί να φωτογραφηθεί και να αποθηκευτεί. Αφού ολοκληρωθεί το βήμα αποχρωματισμού, τοποθετήστε το τζελ κάτω από το σύστημα επεξεργασίας εικόνας για φωτογράφηση και αποθηκεύστε τα αποτελέσματα σε μια δισκέτα.